化妆品功效评价思考与探讨2:美白化妆品功效评价方法

  • 2020-11-04 14:26
  • 作者:何一凡 孙丽丽
  • 来源: ​百事2平台

  皮肤颜色是人体皮肤表面呈现出的色度、色泽,是判断皮肤、身体健康与否的重要标准。随着人们对美白化妆品需求的增长,宣称具有美白功效的化妆品及其原料的产品与日俱增。那么,如何科学、客观地评价化妆品及其原料的美白功效呢?下面我们将为大家汇总常见的美白功效评价方法。


  化妆品功效评价方法大致分为两类。一是体外测试,即通过模拟人体皮肤环境进行评价,包括细胞、组织、体外替代等层次;二是体内测试,即人体测试,通过对人体实际使用效果进行无创测试来评价产品的安全性、功效性。包括:人体安全功效评价、人群试用性评价等层次。美白功效化妆品的评价方法大体也分为如上两类。


  一、体外测试法


  (一)酪氨酸酶活性抑制实验


  人体肤色的差异主要取决于黑色素的含量及其分布,黑色素主要形成于人体皮肤表皮基底层的黑色素细胞,黑色素细胞组织中的酪氨酸在酪氨酸酶等酶的作用下,经多巴、多巴醌、多巴色素、二羟基吲哚等中间体逐步转化为真黑色素。其中酪氨酸酶是黑色素合成的主要限速酶,其活性大小决定黑色素形成的数量。对酪氨酸酶抑制作用的强弱可作为评价增白化妆品的重要参考指标。


  酪氨酸酶活性抑制试验是利用从蘑菇中提取到的酪氨酸酶,以-酪氨酸或L-多巴为底物,在体系中加入待测物、对照品和酪氨酸酶等成分进行反应,并测量其吸光值,计算得到酪氨酸酶抑制率,从而表征待测物对酪氨酸酶活性的抑制。


  (二)抗氧化、抗炎试验


  由于紫外线、体内代谢等内外因素均会促使机体产生氧自由基、炎症因子等。自由基是人体代谢过程中产生的一种垃圾毒素,人类很多疾病的产生都与自由基有关,自由基可直接或间接调控酪氨酸酶的表达,调控黑色素的合成,引起皮肤炎症、加速皮肤黑色素的产生[1]。所以,抑制自由基的产生从一定程度上可以抑制黑色素的产生。常见的自由基有:DPPH、ABTS、超氧阴离子、羟自由基等。可通过测试样品对自由基的抑制率从而表征活性物的抗氧化、美白活性。


  (三)黑色素细胞中的黑色素含量测定实验


  黑色素细胞是机体形成黑色素、分泌黑色素的细胞,是皮肤细胞的重要组成之一。所以,通过细胞生物学法测定黑色素细胞中黑色素含量,是最有力的检测美白产品的方法。


  该实验多通过在体外培养特定的黑色素瘤细胞模型,采用分光光度法、图像分析技术等方法测试细胞内酪氨酸酶活性及黑色素含量,从而对待测物质的美白功效进行评价。为更好地模拟人皮肤中黑色素细胞的生长、黑色素的分泌,研究黑色素细胞与角质形成细胞间的相互作用和美白功效评价,现代生物技术还常常采用黑色素瘤细胞与角质形成细胞共培养模型。


  (四)黑色素的转移


  黑色素生成后需要进行转移才能到达表皮层,该过程分为两步:胞内转移和胞外转移。胞内转移是黑色素细胞受刺激产生的黑色素体,包裹在黑色素细胞中向突起末端迁移。所以,可以通过探究受试物抑制黑色素小体转移的方法,进而评价其美白功效。


  角质形成细胞黑色素摄取实验先在正常人表皮角质形成细胞培养中加入受试物,后加入带有荧光的黑色素颗粒,孵化4h后测量培养基中剩余荧光剂量,以此表示抑制物对黑色素转移的抑制效果。


  (五)非酶糖基化抑制实验


  皮肤老化的一个主要特征就是皮肤变黄和出现老年色斑,其主要原因是脂质过氧化和非酶糖基化反应。其中,生物体内非酶糖基化(Non-EnzymaticGlycation,NEG)反应是指在无酶催化的条件下,还原性糖的醛基或酮基与蛋白质等大分子中的游离氨基以交联或聚合的方式生成棕色、具有荧光性的物质——高级糖基化终产物(AdvancedGlycationEnd-products,AGEs)的过程。AGEs为棕色或者黑色的大分子物质,它出现在真皮和表皮,随着年龄的增大,人体皮肤会出现AGEs的沉积,从而导致皮肤发黄,产生褐斑、老年斑。同时,体内积累的AGEs使相邻的大分子交联,尤其是引起胶原分子间交联,致使结缔组织的通透性降低,养料及废物的扩散性能减弱,组织硬度增加,而且难以被胶原蛋白酶水解,造成皮肤弹性下降,皱纹不易平复而不断加深。


  因此,通过在体外模拟体内蛋白质非酶糖基化的过程,测试受试物抑制AGEs生成过程的能力,可评价被评估物质潜在的抗衰老、美白功效。


  (六)重组皮肤模型替代法


  三维重组皮肤模型是利用组织工程技术,将人的皮肤细胞(含黑色素细胞)培养于特定的培养皿中,构建具有三维结构的人工皮肤组织模型,通过涂抹样品后测定组织的酪氨酸酶活性、黑色素含量及相关酶的表达,从而表征样品对黑色素的抑制作用。


  二、在体测试法


  (一)皮肤颜色测试


  客观仪器评估是通过仪器对受试者使用化妆品前后的皮肤状态参数进行采集,进而对化妆品进行功效评价的一种方法,以数据或图片的形式呈现出来,可以最大限度消除人为因素的影响。


  用于评价皮肤颜色探头式的仪器主要有CK公司的Skin-colorimeterCL400和日本柯尼卡美能达推出的色彩色差仪ChromameterCR-400。这两种探头式仪器均是应用反射分光光度法,通过检测皮肤表层结构上的紫外可见反射光,采用三维颜色空间分量的定量,来模拟并还原描述人肉眼所看到的物体颜色,经过计算综合评价皮肤的色度[2]。


  Skin-ColorimeterCL400以颜色空间(L*a*b和RGB)中的坐标表达颜色,选择国际照明委员会(CIE)规定的Lab色度系统对受试部位的皮肤颜色变化进行测试。Lab色彩空间设计接近人类视学,是对人眼可见光诠释最好的色彩模式。L值表示亮度,值越大,颜色越偏向白色;a值表示红绿色品,+a为红色方向,-a为绿色方向;b值黄蓝色品,+b为黄色方向,-b为蓝色方向。通过前后L、a、b、ITA值的变化来判断皮肤色度的差异。


  (二)皮肤红黑色素测试


  皮肤的颜色主要由皮肤色素含量及其分布决定,人类皮肤的颜色主要取决于人体皮肤中黑色素和血红素(红色素)的含量,快速、准确地测量皮肤中黑色素和血红素的含量在化妆品的研制、医疗、美容、药品和保健品功效检测方面是非常重要的。MexameterMx18也是常用的测定皮肤色度的一种仪器,其结果输出以黑色素指数(MI)和红斑指数(EI)表示,它是基于光谱吸收的原理(RGB),通过特定波长的光照在人体皮肤上的反射量来确定皮肤中黑色素含量,如果测量所得MI越高,说明皮肤中所含的黑色素就越高。


  (三)皮肤黑色素含量测试(Corneomelametry法)


  皮肤颜色是由皮肤中几种发色团的存在和比例引起的,主要包含皮肤中的黑色素、血红素、类胡萝卜素的含量与分布[3]。Corneomelametry法是一种客观的分析方法,可使用光密度测量法量化角质层中黑色素的含量。


  使用透明胶带(氰基丙烯酸酯皮肤表面剥离剂(CSSSs)等)等将受试者的皮肤角质层剥离,然后将剥离的样品用Fotana-Masson银染色,将样品置于配有内部光密度计的显微镜下,测定样品的光透射率,并以220放大倍率拍摄。使用0-10级的灰度判别来评估颜色的密度,从而通过计算来测定角质层细胞中的黑色素含量[4]。


  (四)皮肤光泽度测试


  光泽度是构成物质表面视觉特征的重要参数之一。皮肤光泽度直接关系到光线进入人眼时的视觉效果,平时我们所说的容光焕发指的就是皮肤的光泽度。所以,测定皮肤的光泽度一定程度上也可以表征皮肤的美白效果。目前评价皮肤光泽度的仪器主要有CK公司的Skin-GlossymeterGL200(简称GL200)和法国OrionTechnoLab公司的皮肤光亮度测试仪GonioLux4D。


  (五)VISIA拍照


  应用VISIA拍照,通过对图像的分析也可以评价化妆品的美白功效。常用的仪器设备有美国Canfield公司的Visia和Visia-CR,对于美白功效评价可选用标准光、UV光和交叉偏振光采集面部图像,并使用图像分析软件进行量化分析,以评估皮肤颜色的变化。


  (六)主观评价法


  主观评价法包括专家评估和志愿者自我评估两种方法。专家评估多采用有经验的专家通过使用产品前、后肤色的变化就行评分,从而表征志愿者使用产品前后肤色的变化。志愿者自我评估多采用调查问卷的形式,志愿者对自我肤色的改善情况进行评估。但主观评价法多与客观仪器评价等其他方法结合,从而全面地表征化妆品的美白功效。


  以上是为大家汇总的国内外常用的美白功效评价方法。目前国内外对美白功效的评价并没有一个统一的标准,我们可以根据产品的美白机制和作用途径选择以上的几种方式,从图像、相关指标数据、志愿者或专家的主观评估等多方面对产品的美白功效进行评价。


  延伸阅读


  黑色素的形成及美白剂的作用途径


  追求美是每个女性一生的追求,中国自古就有“一白遮百丑”的说法,追求美丽白皙的肌肤也成为亚洲人孜孜不倦的话题。


  人体肤色主要受到皮肤中色素的含量及分布的影响,这些色素包含了黑色素、血红色、胡萝卜素等,其中黑色素是决定皮肤颜色的主要因素,也是决定性因素。皮肤中的黑色素细胞以酪氨酸为底物,在多种限速酶的氧化作用下生成黑色素,其主要过程为酪氨酸在含高价铜离子的酪氨酸酶作用下氧化生成多巴,再由酪氨酸酶氧化为多巴醌,进一步氧化生成5,6-二羟基吲哚,聚合后生成黑色素。具体物质变化为:酪氨酸一多巴一多巴醌一多巴色素一二羟基吲哚一酮式吲哚一黑色素(优黑色素或真黑色素),黑色素颗粒再由黑色素细胞树突转运至表皮基底层细胞,随着细胞的新陈代谢而被带到角质层中,伴随着角质层的脱落而排出。在黑色素合成过程中,多巴醌还可以通过另一个途径经谷胱甘肽或半胱氨酸催化形成褐黑色素。


  皮肤美白剂的主要作用包括:黑色素合成酶抑制剂、黑色素细胞增殖抑制剂、黑色素运输阻断剂、自由基清除剂、皮肤剥脱剂和遮光剂等。其主要抑制原理如下:


  1.黑色素细胞的胞内抑制


  1.1控制、抑制黑色素生成过程中的相关酶


  黑色素的形成主要受到细胞内四种酶的影响,分别为:酪氨酸酶、多巴色素互变酶、过氧化物酶、二羟基吲哚羧酸(DHICA)氧化酶。所以,想要实现皮肤的美白,抑制黑色素形成过程中相关酶的活性起着重要作用,其中最具代表性的是酪氨酸酶抑制。在黑色素形成过程中,酪氨酸酶是主要的限速酶,该酶活性的大小对黑色素数量的形成起着至关重要的作用。


  1.2破坏黑色素细胞、抑制黑色素颗粒的形成


  通过引起黑色素细胞中毒,从而导致黑色素细胞功能遭到破坏。例如,氢醌可扩散至黑色素小体,阻断黑色素形成,从而引起细胞毒性;壬二酸可作用于活跃的黑色素细胞,阻滞酪氨酸酶蛋白的合成。


  1.3还原黑色素形成过程中的氧化反应


  黑色素形成过程存在众多的氧化反应,加入还原剂可有效阻碍氧化链中的氧化反应,从而减少酪氨酸向黑色素的转化,达到抑制黑色素生成的目的。例如,抗坏血酸是众所周知的抗氧化剂,作用于黑色素细胞可有效抑制多巴和多巴醌的氧化反应。


  2.黑色素细胞的胞外抑制


  2.1抵御紫外线、抑制内皮素的产生


  内皮素是黑色素形成过程中不可缺少的胞外物质,可通过抑制该物质的产生达到抑制黑色素细胞生成的作用。研究表明,皮肤被紫外线照射后角朊细胞释放大量内皮素。内皮素与黑色素细胞膜上的特异受体结合,刺激黑色素细胞的分化、增殖并激活酪氨酸酶的活性,从而使黑色素急剧增加。内皮素不仅能刺激黑色素细胞产生黑色素,同时也是黑色素细胞分裂剂,其细胞信号传递机理已初见端倪。


  2.2抵抗炎症,抑制细胞炎症因子的产生


  很多炎症因子,如IL-3\IL-6\IL-7等对干细胞生长因子的产生具有刺激作用。干细胞生长因子的受体kit是原癌基因c-kit编码的一种跨膜酪氨酸激酶受体。干细胞生长因子与c-kit结合,引起受体自磷酸化和MAPK的激活,MAPK进而磷酸化激活MITF,发挥调节黑色素合成的作用。


  2.3干扰黑色素小体的转移,分散黑色素


  研究表明,部分化妆品原料可阻碍黑色素小体在黑色素细胞与角质形成细胞之间的传递,避免皮肤表皮的色素沉着,从而起到美白的作用,例如烟酰胺。另外a-羟基酸、游离脂肪酸等物质可刺激细胞的更新,促进黑化的角质形成细胞的代谢,加速表皮细胞更新。


  以上为黑色素的形成及现有美白剂的作用途径,企业可根据以上汇总的美白剂的作用途径有针对性的选择功效评价方法,为产品选择客观、科学的功效评价方法。


  参考文献:


  [1]冯法晴,刘有停,董银卯.化妆品美白剂作用机制研究进展[J].香料香精化妆品,2019,06):71-7.


  [2]陶丽莉,刘洋,吴金昊,等.化妆品美白功效评价方法研究进展[J].日用化学品科学,2015,38(03):15-21.


  [3]PETITL,PIRARDGE.Skin-lighteningproductsrevisited[J].InternationalJournalofCosmeticScience,2003,25(4):169-81.


  [4]HERMANNSJF,PETITL,PIRARD-FRANCHIMONTC,etal.AssessmentofTopicalHypopigmentingAgentsonSolarLentiginesofAsianWomen[J].Dermatology,204(4):281-6.


  (作者单位:北京工商大学化妆品监管科学研究院)


(责任编辑:杨畦)

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